Culture cellulaire/Culture de lignées

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Les lignées cellulaires sont des cellules "immortelles", c'est-à-dire que l’on peut maintenir en culture indéfiniment. Ce sont des cellules qui ont été rendues immortelles car :

• elles sont cancéreuses ;
• elles sont contaminées par un virus qui les rend immortelles (comme un virus du groupe Herpès ou le SV40)
• elles ont été modifiées par génie génétique pour être immortelles ; le plus simple étant de leur injecter le gène codant la protéine rendant immortel (comme le gène T du virus SV40).

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Leur culture est considérée comme facile, car elles échappent à tout phénomène de sénescence, et échappent plus ou moins à l'apoptose. Elles s'adaptent donc facilement aux conditions de culture artificielles.

En conséquence, les lignées sont exposées au risque de dérivation de souche, qui pose des problèmes de reproductibilité entre deux laboratoires différents.

En pratique, une lignée est isolée dans un laboratoire X. Ses caractéristiques sont publiées et la lignée est distribuée ou vendue dans le monde entier. Chaque laboratoire va avoir ses propres conditions et habitudes de manipulation, qui vont induire des pressions de sélection différentes. Les lignées sont très adaptables, et vont donc suivre la pression pour s'adapter. Il en résulte que tous les laboratoires qui pensent travailler sur la souche du laboratoire X, travaillent en fait sur des souches légèrement différentes. Plus le temps passe, et plus les habitudes de manipulation sont éloignées des standards, et plus les souches dérivent, ce qui conduit parfois à des querelles entre laboratoires de recherche. Pour cette raison, les laboratoires doivent constituer des banques de lignées, conservées dans l'azote liquide, avec le plus petit nombre de passages possible. Le cas échéant, il faut refaire une expérience avec une lignée "jeune" pour valider ce qu'on a pu obtenir avec une lignée passée des dizaines de fois.

Type de culture

Globalement, il y a deux types de lignées: les cellules adhérentes et les cellules non-adhérentes.

Cellules adhérentes

Particularités

Les cellules adhérentes occupent la surface du flacon de culture, et sont donc soumises à l'inhibition de contact, c'est-à-dire que lorsque la culture approche de la confluence (c'est-à-dire que toute la surface ou presque est occupée par les cellules), les cellules cessent de pousser ou se différencient. Dans les deux cas, la manière avec laquelle les cellules poussent va changer, ce qui perturbera la culture.

Il faut donc passer les cellules avant la confluence. Il faut pour cela les détacher du support pour pouvoir les resuspendre dans du milieu de culture neuf. Pour les détacher, il existe plusieurs méthodes :

• L'utilisation d'un grattoir, qui va racler les cellules ;
• L'utilisation de trypsine, qui va opérer une digestion enzymatique des protéines d'adhésion ;
• L'utilisation d'un chélateur du calcium, type EDTA, qui va empêcher l'action des lectines.

De toutes ces méthodes, la chélation du calcium stresse le moins les cellules, mais ne suffit pas toujours. De plus, cela va empêcher les cellules de coller au plastique ou au verre, mais pas de coller entre elles. De ce point de vue là, l’utilisation de la trypsine sera d'une efficacité maximale.

Comment utiliser la trypsine ?

La plupart du temps, les laboratoires disposent de trypsine diluée, prête à l'emploi. Il faut, avant de mettre la trypsine sur la culture, rincer et laver celle-ci avec un grand volume de NaCl ou de PBS, afin de rincer les protéines du milieu. Ensuite, on ajoute la solution trypsine à raison de 25µL/cm² (au minimum, soit 2mL pour 75 cm²). L'incubation peut se faire au maximum en quinze minutes. Ensuite, lorsque les cellules sont détachées du support, il faut ajouter du milieu contenant des protéines, afin d'arrêter l'action de la trypsine. Pour limiter le stress des cellules, on peut utiliser des solutés à la température de la culture (généralement 37 °C).

La plupart des cellules supportent bien un ensemencement de 20.000 à 40.000 cellules par cm². Certaines cellules très grandes ou poussant très vite peuvent être implantées plus diluées.

Cellules flottantes

Les cellules flottantes occupent le volume de milieu disponible. Elles ne sont pas directement concernées par l'inhibition de contact, mais par la déprivation du milieu en nutriments. Il faut donc surveiller leur densité, la plupart des cellules de type lymphocytaire supportant bien des densités de 10⁵ à 10⁶ cellules par ml. Certains types de cellules, notamment les hybridomes, sont cultivés de manière très dense, pour forcer la production de la protéine d'intérêt.