Culture cellulaire/Notion de stérilité
La notion de stérilité en culture cellulaire est parfois difficile à appréhender. En effet, ce qui est "stérile" ne contient aucun organisme vivant. Mais une culture cellulaire "stérile" désigne en pratique une culture ne contenant que les cellules que l’on souhaite y trouver, et aucun autre organisme vivant.
Stérilisation des milieux
modifierTout ce qui ne doit contenir aucune cellule doit être stérilisé. Pour cela, il faut filtrer, en condition de stérilité (c'est-à-dire sous une flamme ou sous un psm), en utilisant un filtre à pas de 0,22µm. Il existe des filtres de tout type et de tout pas, la plupart nécessitent une dépression pour fonctionner (prise de vide ou trompe à eau). Avec un filtre à 0,22µm, seuls les virus seront conservés.
L'autoclavage (passage à haute température) de certains solutés est possible, mais cette technique ne peut concerner les milieux de cultures, qui contiennent des protéines: l'autoclavage les ferait cuire. Il faut donc réserver cette techniques aux solutés chimiques devant être stériles.
Stérilité des cultures
modifierLa hantise du biologiste est la contamination des cultures. En effet, une cellule dont la culture est colonisée par un autre organisme est très perturbée, car l'étranger induit chez elle du stress par dérivation, car le contaminant prolifère plus vite et consomme les nutriments du milieu, et du stress par signaux de danger, qui modifient profondément les réactions d'une cellule.
Les contaminants les plus courants sont les bactéries de notre peau : E.coli et S.aureus, certaines levures également. Les contaminations par le genre Mycoplasma sont également fréquentes.
Il arrive qu'une culture cellulaire se contamine avec un autre type cellulaire. C’est parfois le cas quand une même personne travaille sur de nombreuses lignées en même temps au même endroit.
Stérilité des surfaces
modifierLa zone propre doit être le plus propre possible, par décontamination régulière utilisant un nettoyant-décontaminant de surface. Par précaution, il faut également nettoyer et décontaminer toute surface entrant dans la zone propre : les flacons, les bouteilles, les gants, les mains...
Détecter une contamination
modifierLe plus souvent, la contamination se perçoit à cause de la turbidité du milieu de la solution d'une part, et de sa couleur d’autre part.
Le contaminant (bactérie ou levure) prolifère plus vite que la plupart des cellules de mammifères. Comme il est plus petit, il va flotter dans le milieu, et lui donner un aspect opalescent qu’il ne devrait pas avoir. Par ailleurs, la plupart des milieux de culture incluent un indicateur de pH. Généralement, la présence de bactéries acidifie le milieu, tandis que celle des levures le rend plus basique. Enfin, au microscope, les levures sont plus grandes que les bactéries, mais toutes les deux donneront un aspect de "sable" au champ de vision.
Pour assurer qu’il s'agit bien d'une contamination, et non de débris ou d'autres corps étrangers, on peut faire un prélèvement et le mettre à pousser dans un milieu bactériologique. Pour une identification précise, il faut faire un prélèvement et la donner à un laboratoire de diagnostic microbiologique.
La contamination par les mycoplasmes est plus pernicieuse. Ce sont des parasites intracellulaires, capables de coloniser toutes les cellules de mammifère, avec les mêmes conséquences que toute autre contamination. Pour déceler leur présence, il faut une microscopie à fluorescence, qui permettra de voir les noyaux des parasites dans le cytoplasme des cellules, ou un kit de détection (par technique ELISA ou par PCR) commercial.
Que faire face à la contamination ?
modifierLe plus simple et le plus prudent consiste à tout jeter à la poubelle, et décontaminer tout ce qui a été en contact avec les cultures contaminées, y compris l'incubateur et le réfrigérateur. Cependant, parfois, quand les cellules cultivées sont précieuses, on va tenter une décontamination, avec des antibiotiques, des antifongiques, ou un tri cellulaire. En gardant en tête que les décontaminations de cellules induisent un stress, et donc favorisent la dérivation des lignées ou le vieillissement des cultures primaires. Quant au tri cellulaire, il ne permet pas de garantir la stérilité de la culture, mais permet d'enrichir la culture en cellules d'intérêt.
