« Cytométrie en flux/Le cytomètre en flux » : différence entre les versions

Pour former ce filet de liquide, la suspension est pompée et envoyée dans un injecteur. L'entraînement de la suspension va se faire grâce à un ''liquide de gaine'', qui va s'écouler autour de l'injecteur de façon laminaire. La pression du liquide de gaine va entraîner le liquide de la suspension et les cellules qu'il contient, et les gouttes vont aisni passer une par une dans le système optique.

 

L'"œil" du cytomètre est constitué de deux systèmes: un système de production de lumière, le plus souvent des lasers; et un système de lecture, constitué d'une série de miroir dichroïques et de filtres optiques.

 

Les cytomètres modernes possèdent en général plusieurs lasers. Chacun permettra d'émettre une lumière monochromatique, capable d'exciter une série de fluorochromes. Le laser le plus courant émet un faisceau à 488nm.

 

{{définition|contenu=Un miroir dichroïque est une surface réflétant la lumière en fonction de la longueur d'onde. }}

 

C'est-à-dire qu'il agit comme un miroir sur une partie de la lumière, et est transparent pour l'autre partie. Il est caractérisé par la longueur d'onde limite (exprimée en nanomètres le plus souvent), qui détermine la limite entre réflexion et transparence. Ce nombre est accompagné de LP ou BP, selon que le filtre laisse passer les longueurs d'ondes supérieures ou inférieures. Ainsi, un miroir 685LP sera un miroir pour toutes les longueurs d'ondes plus courtes que 685, et transparent pour toutes les longueurs d'ondes plus grandes.

 

{{définition|contenu=Un filtre optique est un matériaux étant opaque pour une catégorie de longueur d'onde, transparent pour les autres}}

 

Un filtre optique peut laisser passer la lumière selon trois modalités: à partir d'une longueur d'onde vers les longueurs d'ondes plus petites, plus grands, ou par bande (entre telle et telle longueur d'onde). Les filtres utilisés en cytométrie sont généralement par bande. Ils sont caractérisés par un nombre, qui correspond à la longueur d'onde, exprimée en nanomètres, au centre de la bande de transparence, et un deuxième nombre, qui correspond à la largeur de la bande. Ainsi, un filtre 695/40 laissera-t-il passer la lumière de 655nm à 735nm.

 

Les photomultiplicateurs (PMT) sont des capteurs optiques de même nature que les CCD. Ils sont capables de déceler de très petites quantités de lumière et de le retranscrire en signal électrique, numérique ou analogique selon le cytomètre. Ils sont incapables de faire une différence dans les couleurs ou les longueurs d'onde; toute lumière qui leur parvient a la même valeur. Ils vont donc traduire l'intensité de la ''lumière qui leur parvient''. Le rôle des miroirs et des filtres étant de sélectionner cette lumière en fonction de la longueur d'onde.

 

La plupart des cytomètres et des logiciels d'utilisation fournissent des informations PMT par PMT, en les numérotant. Il faut bien faire attention quand on change de cytomètre, car le PMT numéro x ne "regarde" par forcément la même plage de longueur d'onde !

 

La lumière est émise par le laser. Une partie est transmise par la goutelette: elle passe à travers. Cette lumière est lue directement par un PMT. La différence entre l'intensité de la lumière émise et celle reçue permet de savoir que ''quelque chose'' est passé dans la goutte, car ce ''quelque chose'' a empêché le passage de la lumière. En pratique, plus ce quelque chose est grand, plus le signal diminue: ce signale est une focntion de la taille des cellules. Sur la plupart des appareils, il est nommé Forward Scatter ou FSC.

 

Selon les modèles de cytomètre, il y a un nombre variable de PMT pour chaque laser, et un nombre variable de laser. Quand il y a deux lasers, leurs faisceaux ne sont pas superposés, afin de pouvoir séparer les lumières émises par les fluorochromes excités par leurs lumières respectives. La seule lumite au nombre de PMT, outre leur prix, est leur encombrement, et celui du système optique associé.

 

Généralement, en plus des paramètres bruts, qui mesurent l'intensité du pic de lumière (ou d'ombre, dans le cas du FSC), il est également possible sur certaines machines de calculer deux autres paramètres: l'aire du pic et sa largeur. Ceci est très utile pour différencier les "doublons". Lorsque deux cellules passent dans la même goutte, le signal du pic est plus large que lorsqu'il s'agit d'une cellule seule. Il est possible d'exclure cette goutte, car les paramètre mesurés seront un mélange de ceux des deux cellules.

 

 

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