« Cytométrie en flux/Le cytomètre en flux » : différence entre les versions

Contenu supprimé Contenu ajouté
Aucun résumé des modifications
H'arnet (discussion | contributions)
m Corrections
Ligne 9 :
}}
 
Un ''cytomètre en flux'' est une machine capable de deux choses : examiner une à une une grand nombre de cellulecellules en suspension et générer des informations sur leurs propriétés optiques.
 
Il y a donc quatre parties dans un cytomètre : '''la fluidique''' qui va amener les cellules au niveau du laser., '''Ll`optique''' qui se compose du ou des lasers et d`un système de filtres pour récupérer et amplifier les différents signaux émis., '''l`électronique''' pour mettre en forme les signaux et, enfin, '''l`informatique''' pour visualiser ces signaux.
 
[[Image:Cytometrie Focalisation hydrodynamique.jpg|500px|center|thumb|Schéma]]
 
La particularité des cytomètres est d`analyser une cellule à la fois. Pour cela, les cellules sont '''centrées''' à l`intérieur d`un flux laminaire (on parle de focalisation hydrodynamique) puis '''accélérées''' en passant à travers une buse. Cette accélération àa pour effet de séparer les cellules les unes des autres permettant l`analyse individuelle des cellules.
{{clr}}
Ligne 22 :
 
== L'œil ==
L'"œil" du cytomètre est constitué de deux systèmes : un système de production de lumière, le plus souvent des lasers;, et un système de lecture, constitué d'une série de miroirmiroirs dichroïques et de filtres optiques.
 
=== Les lasers ===
Les cytomètres modernes possèdent en général plusieurs lasers. Chacun permettra d'émettre une lumière monochromatique, capable d'exciter une série de fluorochromes. Le laser le plus courant émet un faisceau à 488nm.
 
=== MiroirMiroirs dichroïques ===
{{définition|contenu=Un miroir dichroïque est une surface reflétant la lumière en fonction de la longueur d'onde. }}
 
Ligne 33 :
 
=== Filtre optique ===
{{définition|contenu=Un filtre optique est un matériauxmatériau étant opaque pour une catégorie de longueur d'onde, transparent pour les autres}}
 
Un filtre optique peut laisser passer la lumière selon trois modalités : à partir d'une longueur d'onde vers les longueurs d'ondes plus petites, plus grandsgrandes, ou par bande (entre telle et telle longueurlongueurs d'onde). Les filtres utilisés en cytométrie sont généralement par bande. Ils sont caractérisés par un nombre, qui correspond à la longueur d'onde, exprimée en nanomètres, au centre de la bande de transparence, et un deuxième nombre, qui correspond à la largeur de la bande. Ainsi, un filtre 695/40 laissera-t-il passer la lumière de 655nm à 735nm.
 
=== Les PMT ===
Les photomultiplicateurs (PMT) sont des capteurs optiques de même nature que les CCD. Ils sont capables de déceler de très petites quantités de lumière et de le retranscrire en signal électrique, numérique ou analogique selon le cytomètre. Ils sont incapables de faire une différence dans les couleurs ou les longueurs d'onde ; toute lumière qui leur parvient a la même valeur. Ils vont donc traduire l'intensité de la ''lumière qui leur parvient''. Le rôle des miroirs et des filtres étant de sélectionner cette lumière en fonction de la longueur d'onde.
 
La plupart des cytomètres et des logiciels d'utilisation fournissent des informations PMT par PMT, en les numérotant. Il faut bien faire attention quand on change de cytomètre, car le PMT numéro x ne "regarde" par forcément la même plage de longueurlongueurs d'ondeondes !
 
=== Le trajet optique et les différents types de paramètres ===
La lumière est émise par le laser. Une partie est transmise par la goutelette : elle passe à travers. Cette lumière est lue directement par un PMT. La différence entre l'intensité de la lumière émise et celle reçue permet de savoir que ''quelque chose'' est passé dans la goutte, car ce ''quelque chose'' a empêché le passage de la lumière. En pratique, plus ce quelque chose est grand, plus le signal diminue : ce signal est une fonction de la taille des cellules. Sur la plupart des appareils, il est nommé Forward Scatter ou FSC.
 
Cette lumière brute du laser est également diffusée par la gouttellette et son contenu. Un PMT, situé en toute fin du trajet optique, et doté d'un filtre n'autorisant le passage que de la lumière émise par le laser, mesure cette lumière diffusée. La lumière est d'autant plus diffusée que la goutte contient de surfaces, car ce sont les surfaces qui diffusent la lumière. La valeur donnée par ce pmt détermine la granulosité des cellules, et porte le nom de Side Scatter ou SSC.
 
La lumière du laser excite également toutes les molécules fluorescentes présentes dans les gouttelettes. Cette lumière ré-émise consiste en un mélange des émissions de toutes ces molécules. Le trajet optique est perpendiculaire au faisceau incident, pour limiter l'éblouïssement des PMT. La disposition des miroirs et des filtres permet d'envoyer sur chaque PMT une bande de longueurlongueurs d'ondeondes différente. Ce sont ces PMT de fluorescences qui sont généralement numérotés Fl1, Fl2, etc...
 
Selon les modèles de cytomètre, il y a un nombre variable de PMT pour chaque laser, et un nombre variable de laserlasers. Quand il y a deux lasers, leurs faisceaux ne sont pas superposés, afin de pouvoir séparer les lumières émises par les fluorochromes excités par leurs lumières respectives. La seule limite au nombre de PMT, outre leur prix, est leur encombrement, et celui du système optique associé.
 
== Analyse du signal ==
Généralement, en plus des paramètres bruts, qui mesurent l'intensité du pic de lumière (ou d'ombre, dans le cas du FSC), il est également possible sur certaines machines de calculer deux autres paramètres : l'aire du pic et sa largeur. Ceci est très utile pour différencier les "doublons". Lorsque deux cellules passent dans la même goutte, le signal du pic est plus large que lorsqu'il s'agit d'une cellule seule. Il est possible d'exclure cette goutte, car les paramètreparamètres mesurés seront un mélange de ceux des deux cellules.
 
Les canaux d'information correspondant à la hauteur du pic, à son aire ou sa largeur, sonsont respectivement notés FSC-H, FSC-A et FSC-W.