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« Cytométrie en flux/Le réglage et la compensation » : différence entre les versions

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Pour régler le gain des PMT, il "suffit" de faire passer une suspension de cellules marquées avec l'isotype correspondant au marquage que l'on souhaite observer ensuite. On définit grâce à ce marquage isotypique la limite entre les évènements "positifs" et "négatifs" selon qu'ils dépassent ou non ce seuil. Pour que cette limite soit facile à mettre, il faut obtenir de la suspension qu'elle produise un signal ni trop fort, pour laisser de la marge aux évènements positifs d'apparaître ensuite, ni trop faible, pour pouvoir observer l'ensemble du nuage négatif.
== Matrice de compensation ==
Les compensationcompensations résultent de deux insuffisances. D'une part, les fluorochromes utilisés n'ont pas une raie d'émission fine, mais un spectre large ; d'autre part les trajets optiques des rayons lumineux ne permettent de sélectionner que des plages de longueurlongueurs d'onde. Il en résulte que certains fluorochromes vont émettre de la lumière dans des longueurs d'ondes captées par un PMT qui ne leur est pas destiné. Pour certains fluorochromes au spectre d'émission très large, ce phénomène peut polluer de nombreux PMT. Le problème posé est donc subtil : un signal fort dans un PMT1 peut provoquer un signal dans un PMT2 sans qu'aucun évènement ne soit positivepositif pour la couleur destinée au PMT2.
 
La solution informatique est simple en théorie: pour corriger l'intensité lumineuse émise par un fluorochrome, perçue en trop par un PMT, on soustrait à ce signal une proportion du signal produtiproduit par le PMT destiné à ce fluorochrome. En pratique, on obtient une matrice de compensation, puisque le signal de chaque PMT doit être compensé pour les signaux de chacun dedes autres.
 
=== Exemple ===
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Les '''isotypes''', ou '''marquage isotypiques''' sont en fait une manière commode de parler de la fluorescence spontanée des cellules traitées avec un anticorps fluorescent mais ne le fixant pas.
 
Le problème vient de ce que les anticoprsanticorps étant des protéines, ils possèdentspossèdent des propriétés d'adhésion variées, et vont plus ou moins s'adsorber (coller aux cellules). Il y a deux paramètres qui font varier cette adsorption : le type de cellule analyséeanalysé et le type d'anticorps utilisé.
#Selon la cellule, la surface sera plus ou moins plissée, plus ou moins riche en protéines d'adhésion, etc..., ce qui pourra faire changer l'adsorption des protéines à sa surface.
#Selon les ''isotypes'' utilisés et l'espèce animale qui a produit l'anticorps, les anticorps vont s'adsorber plus ou moins facilement sur les cellules.
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