« Cytométrie en flux/Le cytomètre en flux » : différence entre les versions

La réalisation des analyses aussi bien que du tri, nécessite une préparation particulière de l'échantillon biologique, aussi bien que l'association de divers principes physiques et technologiques.

 

 

L’analyse devant se faire pour chaque objet individuellement, il est nécessaire que l'échantillon se présente sous la forme d'une suspension. Le sang et la moelle osseuse sont sans conteste les tissus les mieux adaptés à l'analyse en flux. Néanmoins, d'autres tissus biologiques peuvent être analysés, la seule condition étant une dissociation cellulaire préalable (mécanique et/ou enzymatique). Une fois mises en suspension, les cellules ou les particules subcellulaires peuvent être analysées soit sans, soit après fixation (éthanol, paraformaldéhyde, ...). Il convient de savoir que certains fixateurs sont à proscrire en raison de leur auto-fluorescence (ex: glutaraldéhyde).<br />

Par ailleurs, la mesure de composants particuliers de la cellule nécessite leur marquage préalable, soit à l'aide de fluorochromes spécifiques, soit par immunomarquage fluorescent.

 

 

Pour procéder à une analyse individuelle et rapide des cellules, celles-ci sont injectées au centre d'une gaine liquide (généralement du PBS) réalisée par l'intermédiaire d'une buse de 50 à 100μm de diamètre, en utilisant le principe de la focalisation hydrodynamique. Le jet résultant, dont la vitesse varie entre 10 et {{unité|30|{{abréviation|m/s|mètre par seconde}}}} suivant les appareils, va permettre aux cellules de défiler l'une derrière l'autre (1000 à 30000 par seconde), avec suffisamment d'espace entre elles pour être analysées séparément.

 

 

À la sortie de la buse, les cellules passent dans un rayon lumineux focalisé sur le centre du jet, la source lumineuse étant généralement fournie par un laser. Néanmoins certains appareils utilisent des sources lumineuses différentes, telles que lampe à vapeur de mercure ou à xénon. De l'interaction entre le faisceau et les particules, résultent des signaux lumineux, de plusieurs nature:

* La fluorescence, celle-ci pouvant être une auto-fluorescence, ou résulter, comme c’est le cas le plus souvent, d'un marquage par un fluorochrome spécifique d’un constituant cellulaire particulier, ou d’un immunomarquage fluorescent. N.B.: la longueur d’onde d’émission d’un fluorochrome est toujours supérieure à celle de l'excitation, et peut être séparée de celle-ci lors de la collection par les photomultiplicateurs grâce à l’emploi de filtres optiques adéquates.

 

 

Les signaux lumineux sont collectés par des photo-détecteurs (photodiode pour la diffusion petits angles, photomultiplicateurs pour la diffusion grands angles et la fluorescence) qui vont les transformer de façon proportionnelle en signaux électriques.

 

 

À mesure qu’ils sont générés, les signaux électriques sont envoyés sur une console électronique équipée d'un analyseur multicanaux, qui, après les avoir mis en forme, va affecter à l'amplitude de chaque signal un numéro de canal (digitalisation). Ainsi, par empilement successif dans les différent canaux, on obtient un histogramme de la répartition de la population analysée, en fonction du ou des paramètres étudiés.

 

 

Le résultat d’une analyse peut se présenter sous la forme d’histogrammes monoparamétrés (un paramètre en abscisse, l’ordonnée correspondant au nombre d’évènement par canal), ou sous la forme d’histogrammes biparamétrés (un paramètre en abscisse, un paramètre en ordonnée, le nombre d’évènements, correspondant à un axe Z, pouvant être représenté par la densité de nuages de points ou par des courbes de niveau.

 

 

Au delà de leur précision qualitative, les informations contenues dans ces histogrammes, permettent au biologiste d’aborder les problèmes de répartition, de croissance, de régulation, de métabolisme des populations cellulaires à l’aide de statistiques très satisfaisantes (10.000 à 50.000 évènements par fichier).<br />

Par ailleurs, les histogrammes fournis par une analyse en flux se révèlent parfois complexes, et l’extraction des informations qu’ils contiennent nécessite alors l’utilisation de programmes informatiques spécifiques. Les programmes de ce type fournissent des statistiques plus ou moins élaborées, coefficients de variation, pourcentage en fonction des régions, corrélation entre paramètres, directement à partir des données « brutes ». Certains logiciel plus spécifiques, travaillent à partir de modèles tels que ceux qui ont été développés dans le cadre des études du cycle cellulaire.

 

 

Au delà de l'analyse, la particularité de la CMF est d’offrir la possibilité de séparer physiquement des sous-populations mises en évidence par l'analyse.