« Cytométrie en flux/Le réglage et la compensation » : différence entre les versions
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Ligne 13 :
* les réglages d'analyse, qui permettent d'interpréter les résultats.
== Réglage des PMT ==
Pour régler le gain des PMT, il "suffit" de faire passer une suspension de cellules marquées avec l'isotype correspondant au marquage que l’on souhaite observer ensuite. On définit grâce à ce marquage isotypique la limite entre les évènements "positifs" et "négatifs" selon qu’ils dépassent ou non ce seuil. Pour que cette limite soit facile à mettre, il faut obtenir de la suspension qu'elle produise un signal ni trop fort, pour laisser de la marge aux évènements positifs d'apparaître ensuite, ni trop faible, pour pouvoir observer l’ensemble du nuage négatif.
== Matrice de compensation ==
Les compensations résultent de deux insuffisances. D'une part, les fluorochromes utilisés n'ont pas une raie d'émission fine, mais un spectre large ; d’autre part les trajets optiques des rayons lumineux ne permettent de sélectionner que des plages de longueurs d'onde. Il en résulte que certains fluorochromes vont émettre de la lumière dans des longueurs d'ondes captées par un PMT qui ne leur est pas destiné. Pour certains fluorochromes au spectre d'émission très large, ce phénomène peut polluer de nombreux PMT. Le problème posé est donc subtil : un signal fort dans un PMT1 peut provoquer un signal dans un PMT2 sans qu'aucun évènement ne soit positif pour la couleur destinée au PMT2.
La solution informatique est simple en théorie: pour corriger l'intensité lumineuse émise par un fluorochrome, perçue en trop par un PMT, on soustrait à ce signal une proportion du signal produit par le PMT destiné à ce fluorochrome. En pratique, on obtient une matrice de compensation, puisque le signal de chaque PMT doit être compensé pour les signaux de chacun des autres.
=== Exemple ===
{| class="wikitable"
! Avant compensation!! Après compensation
Ligne 54 :
Dans cet exemple, le fluorochrome utilisé en PMT1 produit un signal parasite en PMT2. En utilisant les valeurs produites par des cellules négatives pour les deux canaux, on peut calculer simplement la proportion du signal 1 à ôter du signal 2 pour retrouver une valeur correcte.
=== Problèmes ===
On ne se représente pas immédiatement les problèmes liés à une mauvaise compensation. Si un signal est trop compensé, les résultats seront aussi faux que s'il ne l'est pas assez. Il faut donc prendre un soin particulier à cette opération qui conditionne l'exploitation des données produites.
La compensation représente une opération de plus en plus délicate à mesure que le nombre de PMT utilisés augmente. La matrice de compensation augmente d'autant plus.
== Réglage des isotypes ==
Les '''isotypes''', ou '''marquage isotypiques''' sont en fait une manière commode de parler de la fluorescence spontanée des cellules traitées avec un anticorps fluorescent mais ne le fixant pas.
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