Cytométrie en flux/La fluorescence
La fluorescence est un phénomène chimique, mettant en jeu des transitions électroniques entre deux niveaux d'énergie superficiels, et déclenchée par autre chose que la simple chaleur, ce qui la différencie de l'incandescence.
Principe
modifierDe nombreuses molécules sont capables d'absorber des photons, et d'augmenter leur énergie d'agitation: la lumière est alors convertie en chaleur. Les molécules fluorescentes - on parle de fluorophores ou de fluorochromes- ont la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse et de la restituer, généralement avec une énergie plus basse (une longueur d'onde plus grande).
Ces molécules fluorescentes sont de taille et de nature chimiques diverses ; certaines sont suffisamment petites pour être conjuguées à d’autre molécules (comme dans le cas des anticorps couplés à un fluorochrome); d'autres ne sont fluorescentes que dans certains états de chélation (comme les marqueurs fluorescents vitaux, qui ne sont fluorescents que complexés à l'ADN).
Chaque fluorochrome est caractérisé par :
- sa longueur d'onde d'excitation : la lumière à lui fournir pour que la molécule "fluoresce",
- sa longueur d'onde d'émission : la lumière émise quand la molécule est fluorescente,
- ses conditions de fluorescence: certaines molécules ne sont fluorescentes qu’à certaines conditions.
En pratique courante, pour minimiser les plages de longueurs d'ondes à considérer, les lumières d'excitation sont produites par des lasers, fournissant une lumière monochromatique.
Le transfert d'énergie
modifierIl est possible d'associer deux fluorochromes entre eux, pour obtenir un transfert energétique entre les deux.
Ainsi, une molécule fluorescente A absorbe un photon d'énergie λ1. Elle émet un photon λ2. Une molécule B absorbe un photon d'énergie λ2, et émet un photon λ3. Si on couple ces deux molécules et qu'on fournit des photons λ1 à la molécule A+B, la lumière émise sera composée de photons d'énergie λ3. Ainsi, en excitant A, on a permis à B d'émettre sa fluorescence spécifique. C’est le principe de base qui permet l'extension des gammes de molécules fluorescentes : ainsi, il existe un fluorochrome, la phycoérythrine, qui peut être couplé à divers types de molécules fluorescentes (cyanines, Texas Red, par exemple), et ainsi, avec la même source de lumière, on pourra différencier diverses lumières émises.
Voir aussi
modifier
