Cytométrie en flux/Le cytomètre en flux

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La Cytométrie en Flux (CMF) est une technique permettant l'analyse individuelle et multiparamétrée de cellules ou d'éléments subcellulaires, à une vitesse allant jusqu'à 30000 objets par secondes. Les résultats obtenus se présentent sous la forme d'histogrammes mono- ou biparamétrés, donnant la répartition des cellules en fonction du ou des paramètres étudiés. De plus, au-delà de cette fonction d'analyse, la CMF permet de trier et de séparer physiquement les sous-populations mises en évidence par l'analyse.

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La réalisation des analyses aussi bien que du tri, nécessite une préparation particulière de l'échantillon biologique, aussi bien que l'association de divers principes physiques et technologiques.

Préparation de l'échantillon

L’analyse devant se faire pour chaque objet individuellement, il est nécessaire que l'échantillon se présente sous la forme d'une suspension. Le sang et la moelle osseuse sont sans conteste les tissus les mieux adaptés à l'analyse en flux. Néanmoins, d'autres tissus biologiques peuvent être analysés, la seule condition étant une dissociation cellulaire préalable (mécanique et/ou enzymatique). Une fois mises en suspension, les cellules ou les particules subcellulaires peuvent être analysées soit sans, soit après fixation (éthanol, paraformaldéhyde, ...). Il convient de savoir que certains fixateurs sont à proscrire en raison de leur auto-fluorescence (ex: glutaraldéhyde).
Par ailleurs, la mesure de composants particuliers de la cellule nécessite leur marquage préalable, soit à l'aide de fluorochromes spécifiques, soit par immunomarquage fluorescent.

Défilement accéléré des cellules

Pour procéder à une analyse individuelle et rapide des cellules, celles-ci sont injectées au centre d'une gaine liquide (généralement du PBS) réalisée par l'intermédiaire d'une buse de 50 à 100μm de diamètre, en utilisant le principe de la focalisation hydrodynamique. Le jet résultant, dont la vitesse varie entre 10 et 30 m/s suivant les appareils, va permettre aux cellules de défiler l'une derrière l'autre (1000 à 30000 par seconde), avec suffisamment d'espace entre elles pour être analysées séparément.

Excitation lumineuse

À la sortie de la buse, les cellules passent dans un rayon lumineux focalisé sur le centre du jet, la source lumineuse étant généralement fournie par un laser. Néanmoins certains appareils utilisent des sources lumineuses différentes, telles que lampe à vapeur de mercure ou à xénon. De l'interaction entre le faisceau et les particules, résultent des signaux lumineux, de plusieurs nature:

• La diffusion petits angles (FALS, FSC), collectée dans l’axe du faisceau excitateur, correspond d’un point de vue physique à de la diffraction, et donne une indication sur la taille.
• La diffusion grands angles (WALS, SSC), collectée à 90° par rapport au faisceau lumineux, est un mélange de diffusion, de réflexion et de réfraction, et donne des indications sur la structure interne (granulométrie, rapport nucléo-cytoplasmique,…)
• La fluorescence, celle-ci pouvant être une auto-fluorescence, ou résulter, comme c’est le cas le plus souvent, d'un marquage par un fluorochrome spécifique d’un constituant cellulaire particulier, ou d’un immunomarquage fluorescent. N.B.: la longueur d’onde d’émission d’un fluorochrome est toujours supérieure à celle de l'excitation, et peut être séparée de celle-ci lors de la collection par les photomultiplicateurs grâce à l’emploi de filtres optiques adéquates.

Collection des signaux lumineux et transformation en signaux électriques

Les signaux lumineux sont collectés par des photo-détecteurs (photodiode pour la diffusion petits angles, photomultiplicateurs pour la diffusion grands angles et la fluorescence) qui vont les transformer de façon proportionnelle en signaux électriques.

Traitement des signaux électriques

À mesure qu’ils sont générés, les signaux électriques sont envoyés sur une console électronique équipée d'un analyseur multicanaux, qui, après les avoir mis en forme, va affecter à l'amplitude de chaque signal un numéro de canal (digitalisation). Ainsi, par empilement successif dans les différent canaux, on obtient un histogramme de la répartition de la population analysée, en fonction du ou des paramètres étudiés.

Modes de représentation

Le résultat d’une analyse peut se présenter sous la forme d’histogrammes monoparamétrés (un paramètre en abscisse, l’ordonnée correspondant au nombre d’évènement par canal), ou sous la forme d’histogrammes biparamétrés (un paramètre en abscisse, un paramètre en ordonnée, le nombre d’évènements, correspondant à un axe Z, pouvant être représenté par la densité de nuages de points ou par des courbes de niveau.

Traitement des résultats

Au delà de leur précision qualitative, les informations contenues dans ces histogrammes, permettent au biologiste d’aborder les problèmes de répartition, de croissance, de régulation, de métabolisme des populations cellulaires à l’aide de statistiques très satisfaisantes (10.000 à 50.000 évènements par fichier).
Lorsque pour un paramètre ou une combinaison de paramètres l’analyse révèle plusieurs sous-populations, il est possible de limiter l’acquisition pour d’autres paramètres, à une seule d’entre elles. On parle d’analyse conditionnée. Cette approche est particulièrement intéressante dans l’élimination des objets parasites tels que les doublets ou le bruit de fond.
Par ailleurs, les histogrammes fournis par une analyse en flux se révèlent parfois complexes, et l’extraction des informations qu’ils contiennent nécessite alors l’utilisation de programmes informatiques spécifiques. Les programmes de ce type fournissent des statistiques plus ou moins élaborées, coefficients de variation, pourcentage en fonction des régions, corrélation entre paramètres, directement à partir des données « brutes ». Certains logiciel plus spécifiques, travaillent à partir de modèles tels que ceux qui ont été développés dans le cadre des études du cycle cellulaire.

Le Tri

Au delà de l'analyse, la particularité de la CMF est d’offrir la possibilité de séparer physiquement des sous-populations mises en évidence par l'analyse.

- La première étape, consiste à délimiter les sous-populations que l’on souhaite trier, par ce qu’il est convenu d'appeler des fenêtres de tri. Celles-ci pourront être définies aussi bien sur des histogrammes monoparamétrés que biparamétrés.
- Par ailleurs, on soumet la buse d'où sort le jet à une vibration de faible amplitude mais de relativement haute fréquence (20 à 30 kHz), qui a pour effet de fractionner le jet en gouttelettes. - Lorsque qu'une cellule analysée a été classée dans une fenêtre de tri, l'appareil soumet le jet à une impulsion électrique au moment où cette cellule arrive à l'extrémité du jet non fractionné.
L'excès de charge (+ ou -) résultant, est conservé par la gouttelette contenant la cellule, au moment ou elle se sépare du jet initial.
- En passant ensuite entre deux plaques à haute-tension, cette gouttelette est déviée en fonction de sa charge, pour être collectée dans un tube disposé à cet effet.

Il est ainsi possible de trier simultanément jusqu'à 4 sous-populations révélées par l'analyse. Les cellules triées peuvent ensuite être l’objet d'analyse biochimiques ou de biologie moléculaire, d'études microscopiques, ou, dans le cas de travail sur cellules vivantes, peuvent être remise en culture. Technique largement reconnue et mise à contribution dans de nombreux domaines de la biologie, la CMF a pris aujourd’hui différents aspects, tant par ses applications, que par le matériel utilisé.