Cytométrie en flux/La présentation des informations

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Un cytomètre en flux produit de grandes quantité d'informations, sous forme numérique. Pour chaque évènement qui va passer dans la chambre d'analyse, il y aura autant de paramètres mesurés que de PMT. Ainsi, si on fait passer un million de cellule, marquées avec cinq couleurs différentes de fluorochromes, on obtiendra 7 valeurs par cellules, soit 7 millions de nombres! Pour exploiter ces informations de manière intelligible, il convient de savoir comment les mettre en forme.

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Du fait de la grande variation entre les niveau de fluorescence, l’affichage est souvent fait avec des échelles logarithmiques ou semi-logarithmiques.

Les histogrammes

Les histogrammes sont un graphique représentant la densité d'occurrence d'un paramètre. Pour un paramètre choisi, on affiche l'histogramme montrant le nombre d'évènement en fonction de l'intensité du paramètre mesuré. Ainsi, plus une cellule est fortement marquée pour ce paramètre, plus elle apparaitra sur la droite du graphique. Plus le nombre de cellules analysées augmente, plus les distributions observées ressemblent à ces courbes de Gauss.

Cette représentation à une dimension (un seul paramètre affiché) est utilisée principalement pour visualiser des écarts de fluorescence. Elle nécessite également un traitement des données, pour grouper les évènements par plages.

Les diagrammes à deux dimensions

Il existe plusieurs manière de représenter les données de cytométrie en deux dimensions. Les plus courants sont des modes point par point, par calcul de densité ou par contour.

Les diagrammes points par points

Ce type de graphique affiche un repère à deux dimensions, avec deux paramètres différents en abscisse et en ordonnée. Chaque évènement est représenté par un point, les valeurs mesurées pour les paramètres affichés donnant ses coordonnées dans le repère. On obtient ainsi en nuage de points. Cette représentation est pratique pour visualiser peu de cellules, mais devient impraticable quand il y a trop d'évènements à afficher.

Les diagrammes de densité

Il s'agit ici, non plus de représenter les évènements points par points, mais d'évaluer la densité en évènement à un endroit du graphique. Les évènements individuels sont indiscernables, mais ce mode d'affichage permet de distinguer des régions de plus forte densité, là ou l’affichage point par point n'aurait rendu qu'une plage uniforme. La densité est souvent représentée par des niveaux de gris ou des couleurs.

Les diagrammes de contours

Ce modèle s’apparente aux diagrammes de densité, mais on affiche les courbes de niveaux de densité, avec une précision choisie (en général, 5%, 10% ou 20%). On obtient donc des zones concentriques, qui délimitent les zones de forte densité.

Les diagrammes mixtes

Sur les logiciels modernes, il est possible d'afficher un diagramme de contour et point par point les évènements qui sont dans la dernière tranche de densité. On obtient alors un diagramme qui gère 95 à 80% des évènements avec un affichage en densité, et le reste en points. Cet affichage est utile pour montrer de manière intelligible sur un même graphique des populations représentées dans des proportions très différentes.

Les diagrammes à trois dimensions

Deux dimensions+densité

Ce type de diagramme combine les avantages des graphiques points par points et des diagrammes de densité. Chaque point est représenté sur le plan (x,y) en fonction des deux paramètres à afficher, et la densité en évènement détermine la valeur de la coordonnée (z).

Trois dimensions

Ici, chaque point représentant un évènement est positionné dans un espace à trois dimensions en fonctions des valeurs prises par trois paramètres. Les diagrammes à trois dimensions sont relativement peu utilisés, car leur lisibilité est faible après impression.

La sélection

Un point important de l'analyse des données de cytométrie est la sélection de plages de valeurs pour un paramètre à reporter dans l’affichage d'un autre paramètre. Cette possibilité a priori abstraite revient à ne "regarder" dans un graphique que les évènements qui sont situés dans une zone précise d'un autre graphique.

Ainsi, on affiche un graphique en densité selon deux paramètres: FSC et SSC (la taille et la granulosité). On voit plusieurs populations dévènement, qui sont classiquement :

• Les débris de petite taille
• Les cellules mortes
• Les doublons
• Les cellules elles-mêmes.

Il va de soit que les évènements "utiles" ne sont pas les débris ni les cellules mortes (généralement), ni les doublons. On va donc délimiter grâce au logiciel de rendu une zone de diagramme, qui permettra de n'afficher que les évènements présents dans cette zone dans les diagrammes suivants.

Il est possible de définir plusieurs ensembles suivant différents paramètres, et de les combiner ensembles. Certains logiciels permettent également d'inverser les sélections, et de faire des intersections.

Ces outils sont rendus indispensables par le nombre croissant de canaux disponibles sur les cytomètres. Un cytomètre moderne peut comporter 12 canaux ou plus (plus les FSC et SSC), or il est impossible de présenter de manière intelligible des graphiques en 14 dimensions. La sélections de populations à afficher nous permet d'analyser les données.

Analyse des données

Ce qu'on cherche à voir

Grâce aux différents graphiques, et à la sélection des populations, il est maintenant possible d'exploiter les résultats. On peut voir différents types de résultats.

• une variation dans la fréquence d'une population donnée
• une variation discrète dans l’expression d'un marqueur dans une population donnée, en délimitant deux sous-populations, l'une positive, l'autre négative pour ce marqueur (variation tout ou rien): on voit deux pics d'expression dont les proportions par rapport à la population totale changent.
• une variation globale dans l’expression d'un marqueur dans une population donnée: un décalage est visible dans la distribution de la population.

Ce que nous donne le logiciel

Dans tous les cas, on peut grâce à l'informatique obtenir deux types d'informations sur une population sélectionnée par le logiciel:

• La proportion qu'elle représente par rapport à la population-mère.
• La fluorescence moyenne (MFI, de l'anglais Mean Fluorescence Intensity) de cette population pour chaque PMT. Selon les logiciels d'exploitations, on peut avoir la moyenne géométrique, la moyenne arithmétique ou la médiane.

Il faut noter que les intensité de fluorescences peuvent se comparer à l'intensité du marquage par l'isotype contrôle. On calcule alors un index de fluorescence par rapport à l'isotype, en considérant que l'isotype marque toujours moins que l'anticorps d'intérêt.