Cytométrie en flux/Les anticorps monoclonaux
Les anticorps sont des protéines capable de se lier très fortement à des épitopes, c'est-à-dire des structures tridimensionnelles, le plus souvent des fragments d'autres protéines. Cette interation est hautement spécifique. Il est théoriquement possible de fabriquer des anticorps dirigés contre toutes les protéines, cependant il existe des limitation à celà.
Bref aperçu de la production des anticorps
modifierPour produire un anticorps spécifique contre une protéine X, le plus simple est de choisir un animal et de l'immuniser contre cette protéine. Après quelques temps, l'animal aura développé une réaction immunitaire contre cette protéine, cet antigène. Il faut ensuite collecter ses immunoglobulines sanguines (on a alors un serum anti-X), ou ses plasmocytes. Avec ses plasmocytes, on peut établir des lignées immortelles: les hybridomes. Il est possible d'obtenir des clones d'hybridomes, sécrétant chacun un anticorps anti-X. Un anticorps par clone: c’est un anticorps monoclonal.
Si on utilise l’ensemble des plasmocytes sécrétant des anti-X, on a un mélange d'anticorps: on parle d'anticorps polyclonal.
Les anticorps monoclonaux ont une très haute affinité (sont très spécifiques) de l'antigène, tandis que les anticorps polyclonaux sont très avides. (Voir le cours de pharmacologie).
Bref aperçu de la pharmacologie
modifierLe couple anticorps-antigène possède un Kd (constante de dissociation) de l’ordre de 10-7 à 10-9. Ainsi, même à faible concentration de l'un ou de l'autre, la liaison qui se fera sera en pratique peu réversible aux conditions physico-chimiques compatibles avec la vie (Cependant réversibilité il y a).
Ainsi, mis en contact avec des cellules portant l'antigène X, les anticorps anti-X se fixeront sur la protéine X, et resteront collés à la cellule.
Utilisation en cytométrie
modifierCouplage à un fluorochrome
modifierIl est possible de lier une molécule fluorescente à toute protéine, y compris les anticorps. On obtient alors un anticorps fluorescent.
L'avantage est donc que si on met en contact un mélange de cellule portant ou ne portant X à leur surface, et qu'on ajoute l'anti-X, on verra très vite quelles sont les cellules portant X: ce sont les cellules fluorescentes.
Utilisation d'une révélation
modifierSi on dispose d'un anticorps purifié mais non couplé, il est possible de révéler sa présence en utilisant un anticorps anti-anticorps. En effet, les anticorps sont des protéines comme les autres, et un animal peut produire une réponse immunitaire dirigée contre lui. Il existe une condition cependant. les anti-anticorps sont dirigés contre les fragments constants des immunoglobulines (Ig): les Fc. ces fragments Fc sont conservés par espèce. Il faut donc tenir compte de l'espèce qui a servi à produire l'anticorps. Si l'anti-X est une Ig de rat, il faudra fournir un anticorps anti-rat, produit donc chez un autre animal (souris, lapin, hamster, mule, etc.)
Il est également possible de disposer d'anticoprs couplés à de la biotine. Ceci est pratique, car il existe également des fluorochromes couplés à des avidines. Or, le couple biotine/streptavidine est également très affin, et toute biotine sera associée à de l'avidine, si elle est disponible.
On marque donc les cellules avec l'anticorps purifié, puis après lavage, on incube avec la révélation: anticorps secondaire couplé ou avidine couplée. Il ne reste plus qu’à passer les cellules au cytomètre.
Autres outils
modifierIl existe des protéines spontanément fluorescentes, comme la green fluorescent protéine (GFP), et les protéines dérivées en jaune (YFP), rouge (RFP), etc.
Ce protéines sont souvent utilisées comme rapporteurs: il est possible de produire un animal transgénique dont une catégorie de cellule produira la GFP: elles seront donc vertes, et fluorescentes.
Il existe également des petites molécules fluorescentes, qui collent facilement aux protéines: on peut les utiliser pour colorer des cellules. Ces cellules colorées seront visibles en cytométrie ensuite, ce qui permet de les séparer d'autres cellules. Il est ainsi possible de marquer des cellules, de les injecter à un animal, puis de passer des prélèvements de cet animal au cytomètre: les cellules marquées seront visibles.
